Fluoreszenzbildanalyse – Invasion von 3D-Sphäroiden in ein Kollagengel

Konfokale Bilder der Invasion von Krebs-Sphäroiden in ein Kollagengel wurden mit der NoviSight Software quantitativ ausgewertet, um die Wirkung eines Krebsmedikaments zu bestimmen, das gegen einen für die Tumorinvasion relevanten Faktor gerichtet ist.

Ziele

Die Metastasierungskaskade kann grob in drei Hauptprozesse unterteilt werden: Invasion, Intravasation und Extravasation. Der erste Schritt, die Tumorinvasion, ist fundamental für die Tumorprogression und die treibende Kraft bei der Metastasierung. Die Tumorinvasion umfasst ebenfalls drei Prozesse: Abbau der extrazellulären Matrix (ECM), Verlust der interzellulären Adhäsion und Zellmigration. Die ECM ist die Gesamtheit der extrazellulären Moleküle, beispielsweise Kollagen, Fibronectin, Laminin und Proteoglycane, und bildet ein komplexes Netzwerk. Tumorzellen migrieren kollektiv, indem sie wiederholt die ECM abbauen und wiederherstellen. Zur Beurteilung der Invasionskapazität oder der Wirksamkeit von Arzneimitteln wird häufig ein Wundheilungs-Assay oder ein Transwell-Assay eingesetzt. Diese herkömmlichen Tests sind einfach und kostengünstig, die Tumor-Mikroumgebung wird dabei jedoch nicht berücksichtigt, sodass wichtige Eigenschaften und Funktionen von Zellen wie Polarisation und Zell-Zell-Kommunikation dabei verlorengehen. Daher tragen diese künstlichen Assays zur mangelnden Übertragbarkeit von In-vitro-Ergebnissen zur Wirksamkeit von Arzneimitteln auf In-vivo-Experimente bei. Um eine Tumormikroumgebung nachzubilden, wurde ein dreidimensionaler Invasions-Assay in einem Gel nach und nach ausgeweitet. Mit diesem Assay lässt sich die Tumormikroumgebung durch das Einbetten in eine Gelmatrix simulieren. Die eingebetteten Sphäroide drangen nach und nach in das Gel ein. Dieser Assay kann die Tumormorphologie oder die kollektive Natur der Invasion genau nachbilden. In dieser Studie wurden die NoviSight Software und der 3D-In-Gel-Invasionstest eingesetzt, um die Wirkung von Krebsmedikamenten auf invasive Sphäroide quantitativ zu analysieren. Die Studie belegt die Fähigkeit der Software, die Invasion von komplex geformten Tumoren zu quantifizieren.

Vorbereitung der Proben

Eine Suspension aus humanen HT1080-Fibrosarkomzellen wurden in eine 96-Well-Platte mit U-Boden (Corning Inc.) gegeben (Tag 1). An Tag 3 wurden HT1080-Sphäroide in Matrigel (Corning Inc.) eingebettet. Das Matrigel wurde mit einem Batimastat-haltigen Kulturmedium überschichtet, einem Krebsmedikament, welches spezifisch Matrixmetalloproteinase (MMP) hemmt. An Tag 5 wurden die Zellkerne mit Hoechst 33342 angefärbt.

Schlussfolgerung
Aufnahme und Analyse von Fluoreszenzbildern

Die mikroskopischen Untersuchungen wurden mit dem konfokalen Lasermikroskop FV3000 durchgeführt. An Tag 5 zeigte ein nichtbehandeltes Sphäroid starke Invasivität (A), in Gegenwart von Batimastat war die Invasion jedoch inhibiert (B). Der Invasionsbereich und seine komplexe 3D-Struktur wurden von der NoviSight Software erkannt (C: Der rote Bereich ist das Zentrum eines Sphäroids, der blaue Bereich ist der Projektionsanteil der Invasion). Mit der Volumenanalysefunktion der Software ließ sich nachweisen, dass Batimastat die Invasivität der HT1080-Sphäroide dosisabhängig inhibiert (D).

U-bottom 96-Well Plate ist ein eingetragenes Warenzeichen von Corning Inc.
Olympus ist ein eingetragenes Warenzeichen. NoviSight und Insightful Analysis, Intelligent Answers sind Warenzeichen der Olympus Corporation.