Überwachung des gesamten Prozesses der Differenzierung humaner iPS-Zellen zu Leberorganoiden mit Hilfe des Inkubationsüberwachungssystems CM20

Einleitung

In jüngster Zeit wurden rasche Fortschritte bei der In-vitro-Züchtung von Miniaturgeweben/-organen, sogenannten Organoiden, aus humanen pluripotenten Stammzellen, einschließlich induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS), erzielt. Humane Organoide bieten einzigartige Möglichkeiten für ein breites Spektrum von Bereichen, von der Grundlagenforschung in der Entwicklungsbiologie bis hin zur Krankheitsmodellierung und Arzneimittelentwicklung.

Hintergrund des Experiments

Im Allgemeinen bilden sich Organoide durch Selbstorganisation, bei der sich die Zellen räumlich an für die Differenzierung in spezifische Zelltypen geeigneten Stellen anordnen, was schließlich zur Expression von Organfunktionen führt. Der Prozess der Umwandlung undifferenzierter humaner iPS-Zellen in Organoide eines Zielorgans dauert sehr lange, mindestens einen Monat oder länger. Grund dafür ist das Vorhandensein mehrerer Stadien von intermediär differenzierten Zellen, die den Entwicklungsstadien entsprechen. In vielen Fällen umfassen diese Prozesse auch die Schritte der Einbettung der Zellen in eine extrazelluläre Matrix mit Basalmembrankomponenten, die für die Polarisierung der Zellen und die anschließende Aufrechterhaltung der dreidimensionalen Strukturen unerlässlich ist. Mit anderen Worten: Die erfolgreiche und reproduzierbare Herstellung von Organoiden mit einer bestimmten Qualität aus humanen iPS-Zellen erfordert zwangsläufig eine sorgfältige Prüfung sowohl der zwei- als auch der dreidimensionalen Kulturbedingungen. Neben der Qualitätskontrolle der iPS-Zellen ist es insbesondere wichtig, die Differenzierungsprozesse über einen langen Zeitraum lückenlos zu überwachen und Daten über das dreidimensionale Verhalten und die Morphogenese der Zellpopulationen zu erfassen.

In diesem Anwendungshinweis haben wir versucht, den Differenzierungsprozess mit dem Olympus Provi CM20 Inkubationsüberwachungssystem zu beobachten. Wir haben unsere kürzlich veröffentlichte Methode zur Herstellung humaner Leberorganoide^1,2 als Modellbeispiel verwendet.

Beobachtung der morphologischen Veränderungen während der Bildung des hinteren Darmrohres

Mit Hilfe des CM20 Systems haben wir untersucht, ob es möglich ist, dreidimensionale morphologische Veränderungen im Differenzierungsprozess undifferenzierter humaner iPS-Zellen zu einem zweidimensionalen, blattförmigen, definitiven Endoderm und die anschließende Entstehung von Sphäroiden des hinteren Darmrohres zu beobachten.

Ergebnisse

Mit dem CM20 System konnten wir nicht nur den Erhaltungsprozess der Kultur humaner iPS-Zellen beobachten, sondern auch ihre endgültige Differenzierung zu einem Endoderm und die anschließende Entstehung von Sphäroiden des hinteren Darmrohres. Diese Sphäroide des hinteren Darmrohres entstanden durch die zellautonome Bildung dreidimensionaler Zellaggregate aus dem zweidimensionalen Zellblatt, was zeigt, dass der Prozess solcher morphologischen Veränderungen mit dem CM20 System verfolgt werden kann. Da Organoide anderer endodermaler Organe wie Magen und Darm ebenfalls von primitiven Darmsphäroiden abstammen, die aus dem ausdifferenzierten Endoderm entstanden sind, halten wir das CM20 System allgemein zur Überwachung des Differenzierungsprozesses solcher Organoide für geeignet.

Beobachtung des Kulturprozesses von Leberorganoiden in Matrigel

Anschließend untersuchten wir mit dem CM20 System^*1,, ob es möglich ist, den Kulturprozess von Leberorganoiden, die sich in Matrigel differenzieren und wachsen, dreidimensional zu beobachten.

Ergebnisse

Mit dem CM20 System konnten wir den Differenzierungsprozess von Leberorganoiden in einer dreidimensionalen Kultur mit Matrigeltropfen in einer 24-Well-Platte über etwa 2 Wochen verfolgen.

Zusammenfassung

Mithilfe der automatischen Überwachungsfunktionen der Software des CM20 Systems können der Differenzierungsprozess, der zu morphologischen Veränderungen führt, sowie der Wachstumsprozess dreidimensionaler Organoide in extrazellulärem Matrixgel verfolgt werden. Unser Experiment hat gezeigt, dass das CM20 System den langwierigen Kulturprozess – von der Erhaltung und Handhabung humaner iPS-Zellen bis hin zu ihrer Differenzierung zu Organoiden – überwachen und zur Optimierung und Qualitätskontrolle von Zellkulturen beitragen kann.

Kommentare von Dr. Takebe und Dr. Yoneyama

Literaturnachweise

1. Rie Ouchi, Shodai Togo, Masaki Kimura, Tadahiro Shinozawa, Masaru Koido , Hiroyuki Koike, Wendy Thompson, Rebekah A Karns, et al., „Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids.“ 2019 Aug 6;30(2):374-384.e6. doi: 10.1016/j.cmet.2019.05.007. Epub 2019 May 30. PMID: 31155493 PMCID: PMC6687537 DOI: 10.1016/j.cmet.2019.05.007
2. Tadahiro Shinozawa, Masaki Kimura, Yuqi Cai, Norikazu Saiki, Yosuke Yoneyama, Rie Ouchi, Hiroyuki Koike, Mari Maezawa, et al., „High-Fidelity Drug-Induced Liver Injury Screen Using Human Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids.“ 2021 Feb;160(3):831-846.e10. doi: 10.1053/j.gastro.2020.10.002. Epub 2020 Oct 8. PMID: 33039464 PMCID: PMC7878295 (abgerufen am 2022-02-01) DOI: 10.1053/j.gastro.2020.10.002

*1 Verwendung von Funktionen, die ab Version 1.2.4 des Olympus Provi CM20 Systems zur Verfügung stehen. Laden Sie das Update herunter oder lesen Sie die Software Release Notes, um weitere Informationen zu erhalten.