Digitalisierung sehr dicker Fluoreszenz-Proben mit der SLIDEVIEW VS200 Objektträgerscannereinheit für die Forschung

Einführung

Am Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik (MPI-CBG) in Dresden untersuchen Wissenschaftler die Regenerationsfähigkeit des Plattwurms Schmidtea mediterranea mit der SLIDEVIEW VS200 Scannereinheit von Olympus. S. mediterranea ist ein geeignetes Modell zur Erforschung der Biologie der Systemregeneration.

Vorteile der Verwendung des Plattwurms S. mediterranea:

1. Niedrige Kosten bei der Haltung einer ausreichenden Anzahl Tiere im Labor
2. Genom wurde kürzlich entschlüsselt
3. Es gibt etablierte Werkzeuge und Methoden für Studien zum Verlust der Genfunktion mittels RNA-Interferenz (RNAi)

Erforschung der Regenerationsfähigkeit des Plattwurms Schmidtea mediterranea

Wissenschaftler am MPI-CBG nutzen die außerordentlichen Fähigkeiten des Plattwurms Schmidtea mediterranea. Selbst wenn die Tiere in kleinste Gewebeteile zerschnitten werden, entsteht aus jedem Stück wieder ein perfekt proportionierter Mini-Plattwurm. Adulte Stammzellen spielen bei diesem Prozess eine wichtige Rolle, da bereits eine einzige dieser Zellen wieder einen kompletten Wurm bilden kann.

Die Regenerationsfähigkeit des Plattwurms S. mediterranea ist aktuell Gegenstand zahlreicher Forschungsprojekte. Ein wichtiger Schritt ist die Entschlüsselung des Genoms von Schmidtea mediterranea durch Wissenschaftler am Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik (MPI-CBG) in Zusammenarbeit mit dem Heidelberger Institut für Theoretische Studien (HITS), über die in einem Artikel in der Fachzeitschrift „Nature“ berichtet wird.

Es zeigte sich, dass das Genom eine bisher unbekannte Gruppe von sehr langen Wiederholungseinheiten und neue Plattwurm-spezifische Gene enthält. Andere Gene, die bisher als absolut notwendig für das Überleben eines Tieres galten, fehlen dagegen komplett. Die Entschlüsselung dieses Genoms ist von großer Bedeutung für die Regenerationsforschung, die Stammzellbiologie und vergleichende Bioinformatik.

Aufnahme von hochauflösenden Fluoreszenz-Bildern des Plattwurms Schmidtea mediterranea

Für ihre Untersuchungen benötigen die Wissenschaftler am MPI-CBG ein leistungsstarkes System zum Scannen von Objektträgerpräparaten. Sie verwenden dazu die VS200 Objektträgerscannereinheit, mit der hochauflösende Fluoreszenzbilder aufgenommen werden können.

„Der VS200 Scanner von Olympus ermöglicht die einfache Erfassung hochauflösender Bilder und verfügt darüber hinaus mit TruSight Live über eine Funktion zur Erhöhung der Schärfung in Echtzeit“, erklärte Dr. Tobias Boothe vom MPI-CBG.

Die präparierten Proben sind recht dick, da sie vor der Immobilisierung auf einem Objektträger nicht geschnitten werden. Für diese 200–300 μm dicken Proben sind die Systemfunktionen zur Echtzeitschärfung mit TruSight Live oder Z-Stapel-Bilder unentbehrlich.

Mit der TruSight Live Option kann störendes Streulicht über und unter der Fokusebene reduziert werden. Die Bilddaten werden dann mit einem speziellen 2D-Dekonvolutionsalgorithmus erneut berechnet. Dadurch werden die Bilder schärfer und klarer.

Für die Untersuchung wurde S. mediterranea auf einem Objektträger immobilisiert, mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen (rot und grün) durch In-situ-Hybridisierung von zwei Dotterdrüsenmarkern geschlechtsreifer Tiere gefärbt und bei 10-facher Vergrößerung mit einem VS200 System gescannt. Auch die nukleäre DAPI-Gegenfärbung wurde erfasst. Bei den beiden Plattwurm-Dottermarkern handelte es sich um Ferritin und Surfactant b.

Das Bild links unten zeigt ein Bild ohne Echtzeitschärfung. Im Bild rechts unten wurde die TruSight Live Funktion während der Erfassung auf alle drei Kanäle (DAPI, FITC und CY3) angewendet.

S. mediterranea nach Färbung mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen (rot und grün) durch In-situ-Hybridisierung und mit DAPI-Gegenfärbung bei 10-facher Vergrößerung. Links: Bild ohne Echtzeitschärfung. Rechts: Bild mit Echtzeitschärfung aller drei Kanäle (DAPI, FITC und CY3). Das Bild rechts ist schärfer als das Bild links, da der Streulichtanteil jedes Signals entfernt wurde. Bildquelle: Miquel Vila-Farré, MPI-CBG.

„Die Bilder und Daten, die wir jetzt erfassen, bilden eine wesentliche Grundlage für unsere laufenden Untersuchungen, um den Zusammenhang zwischen der Abundanz des reproduktiven Gewebes beim adulten Plattwurm und der Regenerationsfähigkeit des Tiers zu verstehen. Dafür braucht man mehrere Marker, zum Beispiel die Gene für Surfactant B und Ferritin, wie auf dem Bild zu sehen ist“, erklärte Dr. Miquel Vila-Farré vom MPI-CBG.

Alternativ zu TruSight Live können auch Z-Stapel-Bilder mit max. 31 Ebenen erfasst werden (siehe die folgenden Bilder).

S. mediterranea nach Färbung mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen (rot und grün) durch In-situ-Hybridisierung, gescannt bei 10-facher Vergrößerung. Links: Z-Stapel-Bild mit 31 Ebenen. Rechts: Bild mit einer Ebene. Bildquelle: Miquel Vila-Farré, MPI-CBG.

Nach der Bilderfassung kann das Bild nahtlos mit der Z-Stapel-Funktion fokussiert werden, um die Signalverteilung durch die Probe hindurch zu sehen.

Im folgenden Bildgebungsbeispiel ist eine Zweifarben-In-situ-Hybridisierung von zwei Ausscheidungssystem-Markern bei Schmidtea mediterranea, Smed-Cubilin-1 (FITC, grün) und ein neuartiges Gen (dd_2920, CY3 rot), zu sehen. Zellkerne sind mit DAPI (blau) gegengefärbt. „Um den Aufbau des Ausscheidungssystems des Plattwurms mit dem des Nephrons von Wirbeltieren zu vergleichen, verwendeten wir Smed-Cubilin-1 und dd_2920 als Marker, um zwei verschiedene Zelltypen des Ausscheidungssystems des Plattwurms, die proximale Tubuluszelle und die Filtrationszelle, sichtbar zu machen“, so Dr. Hanh Vu vom MPI-CBG.

In-situ-Hybridisierung mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen (rot und grün) von zwei Ausscheidungssystem-Markern bei S. mediterranea.

Zusammenfassung

Die VS200 Objektträgerscannereinheit von Olympus erfasst hochauflösende Fluoreszenzbilder von sehr dicken Proben, z. B. des Plattwurms Schmidtea mediterranea. Mithilfe von TruSight Live und der Z-Stapel-Funktion lassen sich auch kleine Details in diesen dicken Proben betrachten und analysieren.

Danksagungen
Dieses Anwendungsbeispiel entstand mit Hilfe von Wissenschaftlern des Max-Planck-Instituts für molekulare Zellbiologie und Genetik in Dresden, Sachsen, Deutschland, und von Dr. Daniel Göttel, Application Specialist, Olympus Soft Imaging Solutions in Münster, Deutschland:

• Dr. Tobias Boothe, wissenschaftlicher Mitarbeiter am Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik in Dresden, Sachsen, Deutschland
• Dr. Miquel Vila-Farré, wissenschaftlicher Mitarbeiter am Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik in Dresden, Sachsen, Deutschland
• Dr. Hanh Vu, wissenschaftlicher Mitarbeiter am Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik in Dresden, Sachsen, Deutschland
• Dr. Daniel Göttel, Application Specialist, Olympus Soft Imaging Solutions GmbH in Münster, Deutschland

Literaturnachweis
*Nature; 24. Januar 2018 (DOI: 10.1038/nature25473).