Hochauflösende Bildgebung von Knochenzellinteraktionen mit dem konfokalen Mikroskop FLUOVIEW FV3000 und einem X Line 40x Ölimmersionsobjektiv

Knochen werden fortwährend durch Osteoklasten abgebaut und durch Osteoblasten neu gebildet. Bestimmte Gesundheitsfaktoren können jedoch ein Ungleichgewicht verursachen, das bei Knochenerkrankungen (wie Osteoporose) zu spröden Knochen führt. Um den Mechanismus des Knochenumbaus zu verstehen, ist es wichtig, die Interaktion zwischen Osteoklasten und Osteoblasten zu beobachten.

In dieser Studie haben wir einen Tibia-Querschnitt einer Maus verwendet (Abb. 1) und Osteoklasten und Osteoblasten in der Grenze zwischen Knochenmark und kortikalem Knochen genau beobachtet. Für diese Untersuchung sind normalerweise ein Objektiv mit kleiner Vergrößerung zur Erfassung eines großen Sehfelds und Identifizierung eines interessierenden Bereichs sowie ein Ölimmersionsobjektiv mit großer Vergrößerung zur Betrachtung von Details mit höherer Auflösung erforderlich. Diese Methode kann sich jedoch als umständlich erweisen, da beim Wechseln der Objektive der interessierende Bereich eventuell aus dem Fokus verrückt.

Hier konnten wir den interessierenden Bereich in einem großen Sehfeld identifizieren und feine Strukturen mit hoher Auflösung lediglich mit einem 40x Ölimmersionsobjektiv betrachten, ohne die Objektive zu wechseln.

Abb. 1: Tibia-Querschnitt

Hochauflösende Bildgebung von Knochenzellwechselwirkungen mit einem X- Line 40x Ölimmersionsobjektiv (UPLXAPO40XO)

Wir untersuchten die Grenze zwischen Mark und Kortikalis in einem Querschnitt der Tibia einer Maus, die Kontaktfläche (* in Abb. 2a) von Osteoblasten (grün) und Gefäßendothelzellen (gelb) und den Interaktionsbereich (# in Abb. 2a) von Osteoblasten und Osteoklasten (rot). Das große Sehfeld des 40x Ölimmersionsobjektivs ermöglichte eine Aufnahme, in der die Lage des Bildausschnitts mit hoher Vergrößerung im Übersichtsbild zu sehen ist (Abb. 2a).

Mit dem Scan-Zoom konnte der Interaktionsbereich von Osteoblasten und Osteoklasten genau dargestellt werden (Abb. 2b). Die mit dem X Line Objektiv UPLXAPO40XO erreichte Bildqualität war nahezu dieselbe wie mit einem herkömmlichen Objektiv UPLSAPO60XO (Abb. 2c).

Abb. 2: Fluoreszenzbilder eines Querschnitts der Tibia einer Maus
Bild mit 1x Scan-Zoom mit einem UPLXAPO40XO Objektiv
Bild mit 3,45x Scan-Zoom mit einem UPLXAPO40XO Objektiv
Bild mit 2,03x Scan-Zoom mit einem UPLSAPO60XO Objektiv

Bildgebungsbedingungen
Mikroskop: FV3000 System
Objektiv: UPLXAPO40XO (UPLSAPO60XO als Referenz)
Laser: 488 nm (Alexa Fluor 488, grün), 561 nm (Alexa Fluor 568, rot), 640 nm (Alexa Fluor 647, gelb)

Wie das konfokale Mikroskop FV3000 die Untersuchung erleichterte

Hochleistungsbildgebung mit X Line Objektiven

Die hohe numerische Apertur (NA) der X Line Objektive ermöglichte es, hellere Bilder mit höherer Auflösung zu erfassen. Lesen Sie das White Paper zu X Line Objektiven

Bilderfassung mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis bei schwachem Anregungslicht

Mithilfe der proprietären Spektralerkennungstechnologie kombinieren die TruSpectral Detektoren des konfokalen Mikroskops FV3000 eine hohe Empfindlichkeit mit spektraler Flexibilität, um sogar Fluorophore mit schwachem Signal zu erkennen. TruSpectral Detektoren enthalten bis zu vier Kanäle aus GaAsP-Photomultiplier-Röhren (PMTs) mit einer Quanteneffizienz von bis zu 45 %, sodass Proben angezeigt werden können, die sonst für herkömmliche Geräte zu dunkel waren. Die Peltier-Kühlung reduziert das Hintergrundrauschen bei Bildern mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis bei sehr geringem Anregungslicht um 20 %.

Kommentar von Dr. Yukiko Kuroda

Anmerkungen
Dieses Anwendungsbeispiel wurde mit Hilfe von Dr. Yukiko Kuroda realisiert. Sie ist Dozentin an der Keio University und hat das Bildmaterial in dieser Studie erstellt.