Automatisierte Bildgebung und Quantifizierung von Migrationsassays mit einem Inkubationsüberwachungssystem

Experimenteller Abriss

Informationen zur Zellmigration können in vielen Forschungsbereichen, wie etwa bei der Wundheilung und in der Krebsforschung, nützlich sein. Auf dem Gebiet der Wundheilung werden sie verwendet, um Medikamente zu bewerten, die die Migration von Zellen zum Schließen der Wunde fördern. Im Bereich der Krebsforschung werden sie verwendet, um Medikamente zu bewerten, die die Metastasenbildung und Infiltration von Krebszellen unterdrücken. Eine Möglichkeit, dies zu messen, ist ein Migrationsassay, bei dem adhärente Zellen auf einer Gewebekulturschale dabei beobachtet werden, wie sie sich zu einer zellfreien Stelle bewegen. Der wichtigste und schwierigste Teil bei der Durchführung eines Migrationsassays ist die Festlegung der geeigneten Migrationsdauer. Bei einer zu frühen Analyse eines Migrationsassays sind keine Unterschiede zwischen den Bedingungen zu erkennen, während bei einer zu späten Analyse die ehemals zellfreien Stellen unter den Test- und unter den Kontrollbedingungen bereits vollständig mit Zellen besetzt sind. Früher mussten Migrationsassays zum richtigen Zeitpunkt manuell dargestellt werden, um die erforderlichen Daten für die anschließende manuelle Quantifizierung zu erhalten.

Im Folgenden wird die Analyse der zellmigrationshemmenden Wirkung des Krebsmedikaments Sorafenib auf die menschliche MCF7-Brustkrebszelllinie beschrieben. Zudem wird demonstriert, wie Bildgebung und Quantifizierung von Migrationsassays mit dem Provi CM20 Inkubationsüberwachungssystem von Olympus automatisiert werden können.

Experimentelle Verfahren

MCF7-Zellen wurden in RPMI-1640-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin kultiviert. Die Zellen wurden auf einer 24-Well-Platte mit einem Ibidi Culture-Insert 2 Well (ibidi, Kat.-Nr. ib80209) in einer Dichte von 105.000 Zellen/70 μl/Kammer ausgesät. Das Ibidi Culture-Insert 2 Well wurde 24 Stunden nach der Aussaat entfernt, wodurch eine Lücke für die Zellmigration entstand. Die Zellen wurden dreimal gewaschen und mit Sorafenib (10 oder 30 μM) behandelt oder unbehandelt als Kontrollzellen verwendet. Der CM20 Monitor zeichnete die Zellen bis zu 94 Stunden lang automatisch jede Stunde auf, um die Konfluenz für die Beurteilung der Zellmigration zu quantifizieren.

Ergebnisse

Abbildung 1: Bilder der Zellen während eines Migrationsassays.

Abbildung oben: Kontrollzellen, mittig: 10 μM Sorafenib, unten: 30 μM Sorafenib. Die schattierten Bereiche zeigen konfluente Bereiche an, die vom CM20 Monitor automatisch erkannt wurden.

Die Zellmigration war in beiden mit Sorafenib behandelten Gruppen proportional zur Sorafenib Konzentration reduziert und nach 48 Stunden gab es noch zellfreie Stellen, während es zu diesem Zeitpunkt bei den Kontrollzellen keine zellfreien Stellen mehr gab.

Abbildung 2: Quantifizierung der Konfluenz in einem Migrationsassay.

Abbildung oben: Kontrollzellen, mittig: 10 μM Sorafenib, unten: 30 μM Sorafenib.

Die Quantifizierung der Konfluenz mit dem CM20 Monitor zeigte eine Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Zellbeobachtungen. Die Kontrollzellen zeigten nach 48 Stunden nahezu eine hundertprozentige Konfluenz, während die mit Sorafenib behandelten Zellen proportional zur Sorafenib-Konzentration eine geringere Konfluenz zeigten.

Abbildung 3: Quantifizierung nicht zellfreier Stellen relativ zu Kontrollzellen nach 48 Stunden.

Balken = Mittelwert ± SE, n = 3

Tabelle 1: Quantifizierung der Zellmigration in einem Migrationsassay.

Die Zellmigration wurde bestimmt, indem die Konfluenzgrade zu Beginn der Behandlung von denen nach 48-stündiger Behandlung subtrahiert wurden. Die Zellmigration war proportional zu der Sorafenib-Konzentration erheblich gehemmt.

Vorteile der Bewertungen mit dem Inkubationsüberwachungssystem

Wir konnten die zellmigrationshemmenden Wirkungen des Krebsmedikaments in einem Migrationsassay unter Verwendung des CM20 Inkubationsüberwachungssystems effektiv nachweisen.

Die Einstellung der richtigen Messzeit ist bei einem Migrationsassay von entscheidender Bedeutung. Die Wirkung von Arzneimitteln lässt sich am besten feststellen, wenn sie zum Zeitpunkt der vollständigen Migration unter den schnellsten Bedingungen (d. h. bei den Kontrollzellen in dieser Analyse) bewertet werden. Bisher mussten die Zellen stündlich beobachtet werden, um die Migration zu überprüfen, und daher mussten die Experimente um die personelle Verfügbarkeit herum geplant werden. Selbst dann bestand das Risiko einer vollständigen Migration über Nacht. Der CM20 Monitor löst dieses Problem, indem er die Zellmigration zeitlich festgelegt automatisch abbildet und quantifiziert. Das System ermöglicht es, Zellen zeitpunktunabhängig zu analysieren, was die Arbeitseffizienz erheblich verbessert. Die Verwendung eines Inkubationsüberwachungssystems für Migrationsexperimente birgt das Potenzial der Zeitersparnis sowie der Verbesserung von Genauigkeit und Konsistenz für erfolgreiche Analysen.

Danksagungen

Dieses Anwendungsbeispiel wurde unter Mitarbeit der folgenden Wissenschaftler verfasst:

Takahiro Yamaguchi, PhD, Principal Researcher, ACEL, Inc.